摘要：研究人員開展了關于S-亞硝基化修飾EZH2的研究。
在生命的微觀世界里，細胞的正常運作依賴于各種精細的調控機制。一氧化氮（NO）作為一種多功能的生物活性分子，在細胞功能調節中扮演著重要角色，它可通過S-亞硝基化修飾蛋白質來發揮作用。EZH2是多梳抑制復合物2（PRC2）的關鍵功能性酶組分，負責催化組蛋白H3第27位賴氨酸的甲基化（H3K27me3），進而調控基因表達，在細胞分化、發育以及多種疾病進程中都有著舉足輕重的地位。此前，雖然NO信號通路對血管內皮細胞基因表達有影響，但NO依賴的蛋白質S-亞硝基化修飾在定義內皮細胞表觀遺傳景觀中的作用尚不明確，EZH2的S-亞硝基化修飾及其對該關鍵表觀遺傳調節因子的催化活性、定位和降解的影響也未見報道。為了填補這些知識空白，來自印度比拉理工學院（Birla Institute of Technology and Science）的研究人員開展了深入研究，相關成果發表在《Nature Communications》上，為理解內皮細胞功能調控及相關疾病治療提供了新的視角。
研究人員主要運用了以下幾種關鍵技術方法：一是使用生物素開關法（biotin switch assay）和碘代串聯質譜標簽（iodoTMT）標記試劑檢測EZH2的S-亞硝基化；二是通過免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）實驗探究蛋白質之間的相互作用；三是利用染色質免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）及后續的定量PCR分析基因啟動子區域H3K27me3的富集情況；四是借助分子動力學（MD）模擬從結構層面分析S-亞硝基化對EZH2-SUZ12復合物的影響。
圖1EZH2的S-亞硝基化通過改變PRC2復合物的組裝、甲基轉移酶活性及EZH2的穩定性來維持內皮穩態SNP/GSNO與EZH2的相互作用及對相關指標的影響
研究人員以硝普鈉（SNP）作為外源性NO供體，發現SNP處理人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）和人臍靜脈內皮細胞系（EA.hy926細胞）后，細胞內亞硝酸鹽水平呈時間依賴性增加。SNP可使EZH2蛋白及其催化產物H3K27me3水平降低，且H3K27me3水平在SNP處理1小時后就顯著下降，早于EZH2蛋白在2小時后的降解。進一步研究表明，SNP處理30分鐘時，SUZ12就從EZH2結合的PRC2復合物上解離，導致PRC2復合物催化活性降低。同時，SNP促使EZH2發生胞質轉位，通過亞細胞分級分離和免疫熒光實驗得以證實。為排除SNP作用的非特異性，研究人員使用S-亞硝基谷胱甘肽（GSNO）進行實驗，得到了相似的結果，且GSNO處理后EZH2的相互作用蛋白發生改變，通過質譜分析鑒定出了相關變化的蛋白。
EZH2的S-亞硝基化修飾及對PRC2復合物活性的影響
研究人員通過體外無細胞系統和細胞實驗證實，NO處理可使EZH2蛋白發生S-亞硝基化修飾。生物素開關法和免疫沉淀實驗表明，在EA.hy926細胞中，NO處理后EZH2蛋白被S-亞硝基化。同時，使用天然誘導劑緩激肽（bradykinin）誘導內源性NO產生，也檢測到EZH2蛋白的S-亞硝基化及與SUZ12結合的喪失。此外，H3K27me3組蛋白甲基轉移酶（HMT）活性測定顯示，SNP或GSNO處理后，PRC2復合物的甲基轉移酶活性顯著降低，說明EZH2的S-亞硝基化導致SUZ12從PRC2復合物上早期解離，進而降低其催化活性。
圖2一氧化氮通過誘導SUZ12解離，引發EZH2蛋白的胞質定位與降解，并伴隨H3K27me3水平的早期下降
EZH2降解途徑及內源性NO抑制的影響
研究發現，S-亞硝基化的EZH2主要通過自噬溶酶體途徑降解。使用蛋白酶體抑制劑MG132不能逆轉SNP處理后EZH2的降解，而自噬溶酶體途徑抑制劑巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1）可部分逆轉。同時抑制蛋白酶體和自噬溶酶體途徑，能完全逆轉EZH2的降解，但無法恢復H3K27me3的水平。此外，抑制內源性NO產生機制，如使用eNOSsiRNA敲低HUVEC細胞中的eNOS，或用L-NAME抑制一氧化氮合酶（NOS），可逆轉由VEGF或緩激肽誘導的EZH2和H3K27me3水平的降低，且限制EZH2的胞質轉位，使其定位在細胞核中。
EZH2-H3K27me3軸在糖尿病腎病中的作用及調節效果
研究人員發現，在糖尿病腎病中，EZH2-H3K27me3軸增強。預先用H3K27me3特異性去甲基化酶抑制劑GSK-J4處理細胞，可逆轉SNP誘導的H3K27me3水平降低，并抑制SNP誘導的內皮細胞遷移。通過實時定量PCR（qPCR）和染色質免疫沉淀實驗發現，SNP處理后，與內皮功能相關的基因如VEGFa、TBX20等的轉錄水平增加，且這些基因啟動子區域H3K27me3的富集減少。在高糖環境下，GSNO處理可逆轉高糖誘導的EC和大鼠主動脈中EZH2、H3K27me3水平的升高以及炎癥黏附分子ICAM1的表達，減少單核細胞黏附，這表明S-亞硝基化介導的EZH2調節可能是對抗糖尿病血管并發癥的潛在治療策略。
EZH2特定半胱氨酸殘基S-亞硝基化的作用及分子機制
通過預測工具發現EZH2蛋白的半胱氨酸329（C329）、700（C700）等位點可能發生S-亞硝基化。構建點突變體實驗表明，C329S突變體對SNP處理不敏感，其EZH2蛋白水平未受影響，但H3K27me3水平顯著降低；C700S突變體的EZH2蛋白水平在SNP處理后顯著下降，而H3K27me3水平不變。雙突變體EZH2 C329S C700S對SNP完全不敏感。免疫熒光和共聚焦成像顯示，SNP可誘導野生型EZH2的胞質轉位，但對C329S和雙突變體無此作用。分子動力學模擬顯示，EZH2在C329和C700位點的S-亞硝基化導致EZH2-SUZ12復合物構象改變，使SUZ12與EZH2的SAL結構域結合減弱，最終導致復合物不穩定。
綜上所述，該研究揭示了NO信號通路通過S-亞硝基化修飾EZH2的C329和C700殘基，影響PRC2復合物的穩定性和催化活性，進而調控基因表達，維持內皮穩態。在糖尿病等疾病狀態下，S-亞硝基化修飾EZH2可能成為潛在的治療靶點。不過，研究也存在一定局限性，如未能在體內模型中證實eNOS基因表達或催化抑制對EZH2和H3K27me3的影響。未來研究可進一步探索NO依賴的表觀遺傳通路調控機制，為相關疾病的治療提供更堅實的理論基礎和潛在的治療策略。
參考資料
[1]S-nitrosylation of EZH2 alters PRC2 assembly, methyltransferase activity, and EZH2 stability to maintain endothelial homeostasis
摘要：研究人員開展了關于S-亞硝基化修飾EZH2的研究。
在生命的微觀世界里，細胞的正常運作依賴于各種精細的調控機制。一氧化氮（NO）作為一種多功能的生物活性分子，在細胞功能調節中扮演著重要角色，它可通過S-亞硝基化修飾蛋白質來發揮作用。EZH2是多梳抑制復合物2（PRC2）的關鍵功能性酶組分，負責催化組蛋白H3第27位賴氨酸的甲基化（H3K27me3），進而調控基因表達，在細胞分化、發育以及多種疾病進程中都有著舉足輕重的地位。此前，雖然NO信號通路對血管內皮細胞基因表達有影響，但NO依賴的蛋白質S-亞硝基化修飾在定義內皮細胞表觀遺傳景觀中的作用尚不明確，EZH2的S-亞硝基化修飾及其對該關鍵表觀遺傳調節因子的催化活性、定位和降解的影響也未見報道。為了填補這些知識空白，來自印度比拉理工學院（Birla Institute of Technology and Science）的研究人員開展了深入研究，相關成果發表在《Nature Communications》上，為理解內皮細胞功能調控及相關疾病治療提供了新的視角。
研究人員主要運用了以下幾種關鍵技術方法：一是使用生物素開關法（biotin switch assay）和碘代串聯質譜標簽（iodoTMT）標記試劑檢測EZH2的S-亞硝基化；二是通過免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）實驗探究蛋白質之間的相互作用；三是利用染色質免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）及后續的定量PCR分析基因啟動子區域H3K27me3的富集情況；四是借助分子動力學（MD）模擬從結構層面分析S-亞硝基化對EZH2-SUZ12復合物的影響。
圖1EZH2的S-亞硝基化通過改變PRC2復合物的組裝、甲基轉移酶活性及EZH2的穩定性來維持內皮穩態SNP/GSNO與EZH2的相互作用及對相關指標的影響
研究人員以硝普鈉（SNP）作為外源性NO供體，發現SNP處理人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）和人臍靜脈內皮細胞系（EA.hy926細胞）后，細胞內亞硝酸鹽水平呈時間依賴性增加。SNP可使EZH2蛋白及其催化產物H3K27me3水平降低，且H3K27me3水平在SNP處理1小時后就顯著下降，早于EZH2蛋白在2小時后的降解。進一步研究表明，SNP處理30分鐘時，SUZ12就從EZH2結合的PRC2復合物上解離，導致PRC2復合物催化活性降低。同時，SNP促使EZH2發生胞質轉位，通過亞細胞分級分離和免疫熒光實驗得以證實。為排除SNP作用的非特異性，研究人員使用S-亞硝基谷胱甘肽（GSNO）進行實驗，得到了相似的結果，且GSNO處理后EZH2的相互作用蛋白發生改變，通過質譜分析鑒定出了相關變化的蛋白。
EZH2的S-亞硝基化修飾及對PRC2復合物活性的影響
研究人員通過體外無細胞系統和細胞實驗證實，NO處理可使EZH2蛋白發生S-亞硝基化修飾。生物素開關法和免疫沉淀實驗表明，在EA.hy926細胞中，NO處理后EZH2蛋白被S-亞硝基化。同時，使用天然誘導劑緩激肽（bradykinin）誘導內源性NO產生，也檢測到EZH2蛋白的S-亞硝基化及與SUZ12結合的喪失。此外，H3K27me3組蛋白甲基轉移酶（HMT）活性測定顯示，SNP或GSNO處理后，PRC2復合物的甲基轉移酶活性顯著降低，說明EZH2的S-亞硝基化導致SUZ12從PRC2復合物上早期解離，進而降低其催化活性。
圖2一氧化氮通過誘導SUZ12解離，引發EZH2蛋白的胞質定位與降解，并伴隨H3K27me3水平的早期下降
EZH2降解途徑及內源性NO抑制的影響
研究發現，S-亞硝基化的EZH2主要通過自噬溶酶體途徑降解。使用蛋白酶體抑制劑MG132不能逆轉SNP處理后EZH2的降解，而自噬溶酶體途徑抑制劑巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1）可部分逆轉。同時抑制蛋白酶體和自噬溶酶體途徑，能完全逆轉EZH2的降解，但無法恢復H3K27me3的水平。此外，抑制內源性NO產生機制，如使用eNOSsiRNA敲低HUVEC細胞中的eNOS，或用L-NAME抑制一氧化氮合酶（NOS），可逆轉由VEGF或緩激肽誘導的EZH2和H3K27me3水平的降低，且限制EZH2的胞質轉位，使其定位在細胞核中。
EZH2-H3K27me3軸在糖尿病腎病中的作用及調節效果
研究人員發現，在糖尿病腎病中，EZH2-H3K27me3軸增強。預先用H3K27me3特異性去甲基化酶抑制劑GSK-J4處理細胞，可逆轉SNP誘導的H3K27me3水平降低，并抑制SNP誘導的內皮細胞遷移。通過實時定量PCR（qPCR）和染色質免疫沉淀實驗發現，SNP處理后，與內皮功能相關的基因如VEGFa、TBX20等的轉錄水平增加，且這些基因啟動子區域H3K27me3的富集減少。在高糖環境下，GSNO處理可逆轉高糖誘導的EC和大鼠主動脈中EZH2、H3K27me3水平的升高以及炎癥黏附分子ICAM1的表達，減少單核細胞黏附，這表明S-亞硝基化介導的EZH2調節可能是對抗糖尿病血管并發癥的潛在治療策略。
EZH2特定半胱氨酸殘基S-亞硝基化的作用及分子機制
通過預測工具發現EZH2蛋白的半胱氨酸329（C329）、700（C700）等位點可能發生S-亞硝基化。構建點突變體實驗表明，C329S突變體對SNP處理不敏感，其EZH2蛋白水平未受影響，但H3K27me3水平顯著降低；C700S突變體的EZH2蛋白水平在SNP處理后顯著下降，而H3K27me3水平不變。雙突變體EZH2 C329S C700S對SNP完全不敏感。免疫熒光和共聚焦成像顯示，SNP可誘導野生型EZH2的胞質轉位，但對C329S和雙突變體無此作用。分子動力學模擬顯示，EZH2在C329和C700位點的S-亞硝基化導致EZH2-SUZ12復合物構象改變，使SUZ12與EZH2的SAL結構域結合減弱，最終導致復合物不穩定。
綜上所述，該研究揭示了NO信號通路通過S-亞硝基化修飾EZH2的C329和C700殘基，影響PRC2復合物的穩定性和催化活性，進而調控基因表達，維持內皮穩態。在糖尿病等疾病狀態下，S-亞硝基化修飾EZH2可能成為潛在的治療靶點。不過，研究也存在一定局限性，如未能在體內模型中證實eNOS基因表達或催化抑制對EZH2和H3K27me3的影響。未來研究可進一步探索NO依賴的表觀遺傳通路調控機制，為相關疾病的治療提供更堅實的理論基礎和潛在的治療策略。
參考資料
[1]S-nitrosylation of EZH2 alters PRC2 assembly, methyltransferase activity, and EZH2 stability to maintain endothelial homeostasis
