摘要：麻省總醫院領導的研究團隊近日報告稱，一種新的CRISPR-Cas9變體不需要PAM序列，就能在體外對任何DNA堿基進行切割。
麻省總醫院領導的研究團隊近日報告稱，一種新的CRISPR-Cas9變體不需要PAM序列，就能在體外對任何DNA堿基進行切割。這種可在幾乎任意位點實現精確切割的能力有望應用在多個DNA工程領域。
圖1 新的CRISPR-Cas9變體能在體外對任何DNA堿基進行切割（圖源：[1]）
通常來說，野生型CRISPR-Cas9或Cas12酶需要先識別PAM序列，才能與靶位點結合。同樣，限制性內切酶也只能在特定的DNA位點上進行切割。
麻省總醫院的助理研究員Benjamin Kleinstiver表示：“對于體外應用而言，這意味著研究人員沒有足夠的靈活性來切割任意位點上的DNA，因為我們使用的工具正受到這些短的序列motif的限制?！?/div>
圖2 DNA靶向核酸內切酶的比較（圖源：[1]）
于是，麻省總醫院的研究人員在2020年設計出一種近乎不受PAM限制的變體，并將其命名為SpRY。近日，Kleinstiver及其同事在《Nature Biotechnology》雜志上報告稱，SpRY DNA消化（SpRYgest）過程可在體外切割幾乎任何DNA序列。他們進一步優化了消化過程（包括向導RNA合成），以便其能夠更廣泛地應用。
在分析過程中，研究人員首先比較了野生型SpCas9和變體SpRY在20個不同位點上產生雙鏈斷裂的能力。在20個向導RNA（gRNA）的幫助下，SpCas9可消化其中的4個位點，而SpRY可消化其中的19個位點。
之后，他們比較了野生型SpCas9以及變體SpRY和SpG在64個位點上的活性，SpG也是一種變體，可識別特定的PAM序列。他們的結果突出了SpCas9對NGG PAM的偏好以及SpG對NGN PAM的偏好。相反，SpRY可近乎完全消化64個位點中的59個，表明它確實幾乎不受PAM序列的限制。
SpRYgest可以用在一系列應用中。例如，它可與等溫組裝方法一起用在分子克隆中，比如質粒交換。此外，正如研究人員在論文中所指出的，SpRYgest可用來生成飽和突變文庫，去除NGS文庫中不想要的序列，以及測序方案中的靶向富集。
圖2 DNA靶向核酸內切酶的比較（圖源：[1]）
為了讓SpRYgest得到更廣泛的應用，研究人員還對gRNA合成方案進行了改進。他們將模板生成與體外轉錄（IVT）步驟相結合，將IVT反應時間縮短至4小時以內。研究人員指出，這種one-pot的gRNA合成方法縮短了手動操作時間，降低了實驗成本，讓SpRYgest流程更類似于其他分子克隆方法。
Kleinstiver指出，這些優化方案讓SpRYgest更容易實施。“寡核苷酸可以從供應商處購買，gRNA轉錄試劑盒也可以買到，我們希望以后還可以買到SpRY酶，”他說。他們希望用戶能夠將SpRYgest方法融入現有的分子克隆流程中。
參考資料：
[1] Christie, K.A., Guo, J.A., Silverstein, R.A. et al. Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nat Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01492-y
摘要：麻省總醫院領導的研究團隊近日報告稱，一種新的CRISPR-Cas9變體不需要PAM序列，就能在體外對任何DNA堿基進行切割。
麻省總醫院領導的研究團隊近日報告稱，一種新的CRISPR-Cas9變體不需要PAM序列，就能在體外對任何DNA堿基進行切割。這種可在幾乎任意位點實現精確切割的能力有望應用在多個DNA工程領域。
圖1 新的CRISPR-Cas9變體能在體外對任何DNA堿基進行切割（圖源：[1]）
通常來說，野生型CRISPR-Cas9或Cas12酶需要先識別PAM序列，才能與靶位點結合。同樣，限制性內切酶也只能在特定的DNA位點上進行切割。
麻省總醫院的助理研究員Benjamin Kleinstiver表示：“對于體外應用而言，這意味著研究人員沒有足夠的靈活性來切割任意位點上的DNA，因為我們使用的工具正受到這些短的序列motif的限制。”
于是，麻省總醫院的研究人員在2020年設計出一種近乎不受PAM限制的變體，并將其命名為SpRY。近日，Kleinstiver及其同事在《Nature Biotechnology》雜志上報告稱，SpRY DNA消化（SpRYgest）過程可在體外切割幾乎任何DNA序列。他們進一步優化了消化過程（包括向導RNA合成），以便其能夠更廣泛地應用。
在分析過程中，研究人員首先比較了野生型SpCas9和變體SpRY在20個不同位點上產生雙鏈斷裂的能力。在20個向導RNA（gRNA）的幫助下，SpCas9可消化其中的4個位點，而SpRY可消化其中的19個位點。
之后，他們比較了野生型SpCas9以及變體SpRY和SpG在64個位點上的活性，SpG也是一種變體，可識別特定的PAM序列。他們的結果突出了SpCas9對NGG PAM的偏好以及SpG對NGN PAM的偏好。相反，SpRY可近乎完全消化64個位點中的59個，表明它確實幾乎不受PAM序列的限制。
SpRYgest可以用在一系列應用中。例如，它可與等溫組裝方法一起用在分子克隆中，比如質粒交換。此外，正如研究人員在論文中所指出的，SpRYgest可用來生成飽和突變文庫，去除NGS文庫中不想要的序列，以及測序方案中的靶向富集。
圖2 DNA靶向核酸內切酶的比較（圖源：[1]）
為了讓SpRYgest得到更廣泛的應用，研究人員還對gRNA合成方案進行了改進。他們將模板生成與體外轉錄（IVT）步驟相結合，將IVT反應時間縮短至4小時以內。研究人員指出，這種one-pot的gRNA合成方法縮短了手動操作時間，降低了實驗成本，讓SpRYgest流程更類似于其他分子克隆方法。
Kleinstiver指出，這些優化方案讓SpRYgest更容易實施?！肮押塑账峥梢詮墓烫庂徺I，gRNA轉錄試劑盒也可以買到，我們希望以后還可以買到SpRY酶，”他說。他們希望用戶能夠將SpRYgest方法融入現有的分子克隆流程中。
參考資料：
[1] Christie, K.A., Guo, J.A., Silverstein, R.A. et al. Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nat Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01492-y
