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有木有增加蛋白表達量的轉染試劑？ ——試試Seebio?小西家的陽離子聚合物PEI

  專題推薦     |      2023-08-01
CHO細胞和HEK-293細胞常用于哺乳動物瞬轉系統中快速生產優質的蛋白。然而，研究者在利用瞬時轉染生產重組蛋白時，通常會遇到蛋白表達量極低，成本高昂且操作復雜不利于放大生產等問題。優質的轉染試劑是通往優質蛋白生產瞬轉平臺的必經之路。
自1996年開始陽離子聚合物作為基因轉染載體的研究，聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）作為化學轉染的新寵，近年來倍受關注，無論是科研還是在工業化、大規模瞬時轉染表達重組蛋白或病毒載體領域都是使用廣泛的轉染試劑。西寶生物開發的新一代陽離子聚合物產品著重優化和DNA結合能力。為了更好的了解PEI這款陽離子聚合物產品，本文從PEI的分類，原理，使用及常見問題及產品推薦幾個方面介紹該產品。
PEI的分類
PEI的結構可以寫成是-(CH2CH2NH)n-。根據合成原料與工藝的差異，產物有支鏈PEI與直鏈PEI的差異，2者在應用上存在比較明顯的偏好。支鏈PEI在力學性、加工性、成膜性、薄膜透光性方面更具有優勢，廣泛應用于造紙、石油、輕紡、建筑等領域，而直鏈PEI在真核細胞的基因轉染方面更具有優勢，已廣泛應用于基因轉染方面。
直鏈PEI，應用較廣泛的主要有PEI25000與PEI40000（也有稱PEIMAX），在HEK293和CHO等細胞中轉染效率較高。PEI 40000與PEI 25000轉染試劑相比，具有很多優點。包括：
1.溶解性：PEI 40000較易溶解，可直接在水中溶解，PEI 25000需要先把水調成弱酸性助其溶解，溶解后再用NaOH把pH調至中性；
2.操作性：PEI 40000操作簡便，更易于使用，且比PEI 25000的轉染效果好；
3.穩定性：PEI 25000含有4-11%的丙酰基殘留，其能阻止聚合物主鏈與DNA結合。相較于PEI 25000，PEI 40000是完全脫落的結構，因此其性能始終高效如一。
PEI轉染的原理
陽離子聚合物轉染的共同原理：聚合物把DNA包裹形成復合物，防止被DNase降解，然后附著在細胞膜上被內吞進入胞內，破裂釋放后，DNA進入細胞質中，從而發揮一定的功能。陽離子聚合物和陽離子脂質體的主要區別在于其不含疏水部分而完全溶于水，并可以方便地進行化學修飾。
直鏈PEI單體中每3個原子含1個氮，形成胺基。每相隔二個碳原子，即每第三個原子都是質子化的氨基氮原子，使得聚合物網絡在pH下都能充當有效的質子海綿(proton sponge)體。這是PEI有較強的結合DNA和黏附細胞，能作為基因轉導載體的重要原因。針對這個特點西寶生物開發的新一代陽離子聚合物產品著重優化和DNA結合能力。
pH值與質子化關系
圖1. pH值與質子化關系（源自：doi.org/10.1021/acs.macromol.0c01501）
PEI 能將 DNA 包裹成帶正電荷的微粒，這些微粒可以黏合到帶有負電荷的細胞表面殘基，并通過胞吞作用進入細胞。一旦進入細胞，胺的質子化導致反離子大量涌入以及滲透勢降低，在低pH環境中實現DNA胞內釋放。普遍被接受的觀點是PEI上未質子化的胺可以在與膜結合的細胞器（如溶酶體）中吸收氫離子，這將導致更多氫離子的流入，誘發滲透溶脹。而質子化胺之間的排斥引起PEI構象的改變，上述變化導致的滲透膨脹使囊泡釋放聚合物與 DNA 形成的復合物進入細胞質。復合物拆解后，DNA 能自由的融合到細胞核中。
PEI轉染原理
圖2. PEI轉染原理 (選自Current Protocols in Chemical Biology 9:147–157, September 2017)
產品優勢
1.轉染效率高：適合轉染DNA，細胞密度在70%~80%時，轉染效率可以達到80%以上；
2.應用范圍廣：既適用于HEK293等真核貼壁細胞的轉染 也適用于懸浮細胞的轉染，并且適用于有血清和無血清的轉染條件。
3.蛋白表達量高： 少量的轉染試劑獲得高產量的蛋白表達，性價比高，適用于大規模的轉染。
4.無機試劑，無動物源成分
5.低毒性：轉染細胞形態良好并表達大量的目的蛋白；
6.產品穩定，質控嚴格；
不同細胞系參考數據 以48孔板為例（數據僅供參考）
細胞類型
培養體系
轉染時細胞匯合度
DNA
Seebio PEI（1mg/mL）
293H
DMEM
70-80%
0.2ug
0.2uL
293FT
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
293E
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
293F
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
COS7
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
hela
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
CaCO2
MEM
70-80%
0.2ug
0.9uL
BHK21
MEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
RAW264.7
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
SW480
IMDM
70-80%
0.2ug
0.6uL
MDCK
DMEM
70-80%
0.2ug
1uL
CHO-K1
IMDM
70-80%
0.2ug
1uL
HepG2
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
A549
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
NIH/3T3
DMEM
70-80%
0.2ug
0.9uL
Vero
DMEM
70-80%
0.2ug
0.9uL
sf9
SIM SF
70-80%
0.2ug
0.9uL
不同培養體系參考值
培養皿
表面積(cm2)
培養基總量
DNA的量(ug)
轉染試劑的量(uL)
稀釋液體積(uL)
96孔板
0.3
100uL
0.1
0.3
10
48孔板
0.7
200uL
0.2
0.6
20
24孔板
1.9
500uL
0.5
1.5
50
12孔板
3.8
1mL
1
3
100
6孔板
10
2 mL
2
6
200
25cm2培養瓶
21
4 mL
4
12
400
75cm2培養瓶
58
10 mL
10
30
1000
轉染中的常見問題
1.轉染效率低
原因：(1)細胞活力：使用活力好傳代小于15代的細胞。
(2)細胞接種密度高/低：適當降低/增加接種密度。
(3)PEI/DNA比率不合適：進行不同基因轉染時應對PEI和DNA的比例進行優化，以達到合適比例。
(4)質粒片段較大：可根據實際實驗需要調整，如適當增加轉染質粒總量等。
(5)混合方式不當：質粒DNA和PEI溶液混合時避免渦旋。同時要注意PEI加入 DNA溶液中的順序。
2.細胞毒性高
原因：(1)轉染液孵育時間過長：過長時間 PEI/DNA 復合體會導致細胞毒性。
(2)細胞接種密度低：適當增加接種密度。
(3)PEI/DNA比例高：優化合適的PEI和DNA的比例。
3.轉染效果不穩定，重復性不好
原因： 轉染效果不穩定一般與兩個因素緊密相關，一個是轉染試劑的穩定性，另一個是基因的穩定性。轉染試劑應按照說明書建議的保存溫度及條件進行保存。溶解后則不建議反復凍融。如短時間內連續使用，可放置于4℃保存。若超過10天不使用，不建議使用。
產品選擇指南
目前西寶生物（Seebio）提供了多種形式的轉染試劑，客戶可根據轉染核酸的種類/貼壁細胞/懸浮細胞等條件，選擇合適的轉染試劑。具體選擇指南如下：
產品種類
核酸類型
細胞類型
是否可替換
Seebio?聚乙烯亞胺PEI（Polyethylenimine）轉染試劑 (貨號：AJL0940C)
DNA
貼壁細胞
懸浮細胞
可替換lipo3000，jet PEI
線性PEI轉染試MW25000(貨號：AJL0115C)
DNA
貼壁細胞
懸浮細胞
可替換PEI 25KTM(23966)
線性PEI轉染試劑(速溶型)MW40000(貨號：AJL0940B)
DNA
貼壁細胞
懸浮細胞
可替換PEI MAX 40K(24765)
訂購信息
即用型
品牌
貨號
產品名稱
規格
Seebio
Seebio?聚乙烯亞胺PEI（Polyethylenimine）轉染試劑
1ml
10ml
50ml
100ml
粉末非即用型
Seebio
Seebio?線性聚乙烯亞胺，MW40000
10mg
100mg
1g
Seebio
Seebio?線性聚乙烯亞胺， MW25000
1g
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品牌
貨號
產品名稱
規格
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Hanks平衡鹽粉劑(1×HBSS,含酚紅)
1L
Seebio
PBS緩沖液
500ml
WAKO
293-72601
D-PBS(-),Powder
1L×10
299-72603
10L
WAKO
Penicillin-Streptomycin Solution（×100）
青霉素-鏈霉素溶液（×100）
100mL
WAKO
Penicillin-Streptomycin Solution（×50）
青霉素-鏈霉素溶液（×50）
100mL
Seebio 293細胞專用培養基
產品編號
產品名稱
產品說明
規格
SeeHEK293CD01基礎培養基(液體)
(無動物源，化學成分限定,不含水解物，含微量生長因子)
1L
SeeHEK293CD01基礎培養基(干粉)
(無動物源，化學成分限定,不含水解物，含微量生長因子)
10L
100L
SeeHEK293CD02基礎培養基(液體)
(無動物源，化學成分限定,不含水解物和生長因子)
1L
SeeHEK293CD02基礎培養基(干粉)
(無動物源，化學成分限定,不含水解物和生長因子)
10L
100L
SeeHEK293CD03基礎培養基(液體)
原始培養基已經含有4mM Gln
1L
SeeHEK293CD03,基礎培養基(干粉)
原始培養基已經含有4mM Gln
10L
100L
SeeHEK293FM01補料培養基(液體)
液體補料A含有60g/L的葡萄糖，補料B不含葡萄糖
1L+100ml
SeeHEK293FM01補料培養基(干粉)
液體補料A含有60g/L的葡萄糖，補料B不含葡萄糖
10L+1L
100L+10L
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含有細胞分泌物的培養液
10ml
250ml
WAKO BalanCD 無血清細胞培養基
  1. cGMP級別
  2. 可以提供液體及粉末形式
  3. 無血清
  4. 已取得DMF
  5. 化學成分限定
  6. 適應小試劑放大
HEK293系列：基因治療病毒載體生產，蛋白瞬時表達 - 重組蛋白生產
貨號
產品名稱
規格
91165-1L
BalanCD HEK293
BalanCD HEK293培養基
1L
94137-10L
10L
94137-100L
100L
91166-500ML
BalanCD HEK293 Feed
BalanCD HEK293補料
500mL
981444-10L
10L
981444-100L
100L
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貨號
產品名稱
規格
WAKO

Sodium Dextran Sulfate 5,000
葡聚糖硫酸鈉鹽5,000（生化級）

25g
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100g
WAKO
500g
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Sodium Dextran Sulfate 5,000
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25g
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100g
WAKO
500g
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品牌
貨號
產品名稱
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Antifoam SI
消泡劑 SI

100ml
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500ml
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500ml
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100ml
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500ml
WAKO

Antifoam PE-L
消泡劑 PE-L (參考)在20℃時，粘度約160cP

100ml
WAKO
500ml
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貨號
產品名稱
規格
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120mL

 

CHO細胞和HEK-293細胞常用于哺乳動物瞬轉系統中快速生產優質的蛋白。然而，研究者在利用瞬時轉染生產重組蛋白時，通常會遇到蛋白表達量極低，成本高昂且操作復雜不利于放大生產等問題。優質的轉染試劑是通往優質蛋白生產瞬轉平臺的必經之路。
自1996年開始陽離子聚合物作為基因轉染載體的研究，聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）作為化學轉染的新寵，近年來倍受關注，無論是科研還是在工業化、大規模瞬時轉染表達重組蛋白或病毒載體領域都是使用廣泛的轉染試劑。西寶生物開發的新一代陽離子聚合物產品著重優化和DNA結合能力。為了更好的了解PEI這款陽離子聚合物產品，本文從PEI的分類，原理，使用及常見問題及產品推薦幾個方面介紹該產品。
PEI的分類
PEI的結構可以寫成是-(CH2CH2NH)n-。根據合成原料與工藝的差異，產物有支鏈PEI與直鏈PEI的差異，2者在應用上存在比較明顯的偏好。支鏈PEI在力學性、加工性、成膜性、薄膜透光性方面更具有優勢，廣泛應用于造紙、石油、輕紡、建筑等領域，而直鏈PEI在真核細胞的基因轉染方面更具有優勢，已廣泛應用于基因轉染方面。
直鏈PEI，應用較廣泛的主要有PEI25000與PEI40000（也有稱PEIMAX），在HEK293和CHO等細胞中轉染效率較高。PEI 40000與PEI 25000轉染試劑相比，具有很多優點。包括：
1.溶解性：PEI 40000較易溶解，可直接在水中溶解，PEI 25000需要先把水調成弱酸性助其溶解，溶解后再用NaOH把pH調至中性；
2.操作性：PEI 40000操作簡便，更易于使用，且比PEI 25000的轉染效果好；
3.穩定性：PEI 25000含有4-11%的丙酰基殘留，其能阻止聚合物主鏈與DNA結合。相較于PEI 25000，PEI 40000是完全脫落的結構，因此其性能始終高效如一。
PEI轉染的原理
陽離子聚合物轉染的共同原理：聚合物把DNA包裹形成復合物，防止被DNase降解，然后附著在細胞膜上被內吞進入胞內，破裂釋放后，DNA進入細胞質中，從而發揮一定的功能。陽離子聚合物和陽離子脂質體的主要區別在于其不含疏水部分而完全溶于水，并可以方便地進行化學修飾。
直鏈PEI單體中每3個原子含1個氮，形成胺基。每相隔二個碳原子，即每第三個原子都是質子化的氨基氮原子，使得聚合物網絡在pH下都能充當有效的質子海綿(proton sponge)體。這是PEI有較強的結合DNA和黏附細胞，能作為基因轉導載體的重要原因。針對這個特點西寶生物開發的新一代陽離子聚合物產品著重優化和DNA結合能力。
pH值與質子化關系
圖1. pH值與質子化關系（源自：doi.org/10.1021/acs.macromol.0c01501）
PEI 能將 DNA 包裹成帶正電荷的微粒，這些微粒可以黏合到帶有負電荷的細胞表面殘基，并通過胞吞作用進入細胞。一旦進入細胞，胺的質子化導致反離子大量涌入以及滲透勢降低，在低pH環境中實現DNA胞內釋放。普遍被接受的觀點是PEI上未質子化的胺可以在與膜結合的細胞器（如溶酶體）中吸收氫離子，這將導致更多氫離子的流入，誘發滲透溶脹。而質子化胺之間的排斥引起PEI構象的改變，上述變化導致的滲透膨脹使囊泡釋放聚合物與 DNA 形成的復合物進入細胞質。復合物拆解后，DNA 能自由的融合到細胞核中。
PEI轉染原理
圖2. PEI轉染原理（選自Current Protocols in Chemical Biology 9:147–157, September 2017）
產品優勢
1.轉染效率高：適合轉染DNA，細胞密度在70%~80%時，轉染效率可以達到80%以上；
2.應用范圍廣：既適用于HEK293等真核貼壁細胞的轉染 也適用于懸浮細胞的轉染，并且適用于有血清和無血清的轉染條件。
3.蛋白表達量高： 少量的轉染試劑獲得高產量的蛋白表達，性價比高，適用于大規模的轉染。
4.無機試劑，無動物源成分
5.低毒性：轉染細胞形態良好并表達大量的目的蛋白；
6.產品穩定，質控嚴格；
不同細胞系參考數據 以48孔板為例（數據僅供參考）
細胞類型
培養體系
轉染時細胞匯合度
DNA
Seebio PEI（1mg/mL）
293H
DMEM
70-80%
0.2ug
0.2uL
293FT
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
293E
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
293F
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
COS7
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
hela
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
CaCO2
MEM
70-80%
0.2ug
0.9uL
BHK21
MEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
RAW264.7
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
SW480
IMDM
70-80%
0.2ug
0.6uL
MDCK
DMEM
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0.2ug
1uL
CHO-K1
IMDM
70-80%
0.2ug
1uL
HepG2
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
A549
DMEM
70-80%
0.2ug
0.6uL
NIH/3T3
DMEM
70-80%
0.2ug
0.9uL
Vero
DMEM
70-80%
0.2ug
0.9uL
sf9
SIM SF
70-80%
0.2ug
0.9uL
不同培養體系參考值
培養皿
表面積(cm2)
培養基總量
DNA的量(ug)
轉染試劑的量(uL)
稀釋液體積(uL)
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0.3
100uL
0.1
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200uL
0.2
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1.9
500uL
0.5
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3.8
1mL
1
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10
2 mL
2
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200
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21
4 mL
4
12
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58
10 mL
10
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轉染中的常見問題
1.轉染效率低
原因：(1)細胞活力：使用活力好傳代小于15代的細胞。
(2)細胞接種密度高/低：適當降低/增加接種密度。
(3)PEI/DNA比率不合適：進行不同基因轉染時應對PEI和DNA的比例進行優化，以達到合適比例。
(4)質粒片段較大：可根據實際實驗需要調整，如適當增加轉染質粒總量等。
(5)混合方式不當：質粒DNA和PEI溶液混合時避免渦旋。同時要注意PEI加入 DNA溶液中的順序。
2.細胞毒性高
原因：(1)轉染液孵育時間過長：過長時間 PEI/DNA 復合體會導致細胞毒性。
(2)細胞接種密度低：適當增加接種密度。
(3)PEI/DNA比例高：優化合適的PEI和DNA的比例。
3.轉染效果不穩定，重復性不好
原因： 轉染效果不穩定一般與兩個因素緊密相關，一個是轉染試劑的穩定性，另一個是基因的穩定性。轉染試劑應按照說明書建議的保存溫度及條件進行保存。溶解后則不建議反復凍融。如短時間內連續使用，可放置于4℃保存。若超過10天不使用，不建議使用。
產品選擇指南
目前西寶生物（Seebio）提供了多種形式的轉染試劑，客戶可根據轉染核酸的種類/貼壁細胞/懸浮細胞等條件，選擇合適的轉染試劑。具體選擇指南如下：
產品種類
核酸類型
細胞類型
是否可替換
Seebio?聚乙烯亞胺PEI（Polyethylenimine）轉染試劑 (貨號：AJL0940C)
DNA
貼壁細胞
懸浮細胞
可替換lipo3000，jet PEI
線性PEI轉染試MW25000(貨號：AJL0115C)
DNA
貼壁細胞
懸浮細胞
可替換PEI 25KTM(23966)
線性PEI轉染試劑(速溶型)MW40000(貨號：AJL0940B)
DNA
貼壁細胞
懸浮細胞
可替換PEI MAX 40K(24765)
訂購信息
即用型
品牌
貨號
產品名稱
規格
Seebio
Seebio?聚乙烯亞胺PEI（Polyethylenimine）轉染試劑
1ml
10ml
50ml
100ml
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Seebio
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10mg
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100mL
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產品編號
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SeeHEK293CD01基礎培養基(液體)
(無動物源，化學成分限定,不含水解物，含微量生長因子)
1L
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(無動物源，化學成分限定,不含水解物，含微量生長因子)
10L
100L
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(無動物源，化學成分限定,不含水解物和生長因子)
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SeeHEK293CD02基礎培養基(干粉)
(無動物源，化學成分限定,不含水解物和生長因子)
10L
100L
SeeHEK293CD03基礎培養基(液體)
原始培養基已經含有4mM Gln
1L
SeeHEK293CD03,基礎培養基(干粉)
原始培養基已經含有4mM Gln
10L
100L
SeeHEK293FM01補料培養基(液體)
液體補料A含有60g/L的葡萄糖，補料B不含葡萄糖
1L+100ml
SeeHEK293FM01補料培養基(干粉)
液體補料A含有60g/L的葡萄糖，補料B不含葡萄糖
10L+1L
100L+10L
Seebio? 條件培養液(293T)
含有細胞分泌物的培養液
10ml
250ml
WAKO BalanCD 無血清細胞培養基
  1. cGMP級別
  2. 可以提供液體及粉末形式
  3. 無血清
  4. 已取得DMF
  5. 化學成分限定
適應小試劑放大
HEK293系列：基因治療病毒載體生產，蛋白瞬時表達·重組蛋白生產
貨號
產品名稱
規格
91165-1L
BalanCD HEK293
BalanCD HEK293培養基
1L
94137-10L
10L
94137-100L
100L
91166-500ML
BalanCD HEK293 Feed
BalanCD HEK293補料
500mL
981444-10L
10L
981444-100L
100L
防止細胞結團
品牌
貨號
產品名稱
規格
WAKO

Sodium Dextran Sulfate 5,000
葡聚糖硫酸鈉鹽5,000（生化級）

25g
WAKO
100g
WAKO
500g
WAKO

Sodium Dextran Sulfate 5,000
葡聚糖硫酸鈉鹽5,000（分子級）

25g
WAKO
100g
WAKO
500g
消泡劑
品牌
貨號
產品名稱
規格
WAKO

Antifoam SI
消泡劑 SI

100ml
WAKO
500ml
WAKO

Antifoam PE-H
消泡劑 PE-H (參考)在20℃時，粘度約983cP

100ml
WAKO
500ml
WAKO
Antifoam PE-M 消泡劑 PE-M (參考)在20℃時，粘度約325cP
100ml
WAKO
500ml
WAKO
Antifoam PE-L 消泡劑 PE-L (參考)在20℃時，粘度約160cP
100ml
WAKO
500ml
細胞解離
品牌
貨號
產品名稱
規格
WAKO
203-20251

Trypsin-EDTA Solution without Phenol Red, AF
胰蛋白酶EDTA溶液（無酚紅）

100ml
WAKO
207-20271

Trypsin-EDTA Solution (High Trypsin) without Phenol Red, AF
胰蛋白酶EDTA溶液（無酚紅）

100ml
WAKO細胞凍存
BAMBANKER 無血清細胞凍存液 用戶文獻眾多
產品編號
英文名稱
應用
規格
BAMBANKER'
常規工具細胞，干細胞，PBMCs,免疫細胞，類器官等
120mL
306-14684
20mL×5
PRIME-XV 無DMSO 凍存液 無動物源成分，化學成分限定，已取得美國FDA DMF
產品編號
英文名稱
應用
規格
91140-10ml
PRIME-XVFreezISDMSO free
干細胞
10mL
91140-100ml
100mL
iStock 無血清細胞凍存液 無異源，已取得日本《再生醫療等制品材料適格性確認書》
產品編號
英文名稱
應用
規格
385-19451
iStockXeno-Free Freezing medium
人免疫細胞，PBMCs,MSCs,iPS等
120mL